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密度梯度离心机在实验中时如何进行操作的?

点击次数:222 发布时间:2019-09-20
   密度梯度离心机的工作原理:
  用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。
 
  分离活细胞的介质要求:
  1、能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高;
  2、PH中性或易调为中性;
  3、浓度大时渗透压不大;
  4、对细胞无毒。
 
  密度梯度离心机的操作过程如下:
  1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3次后,置-20℃冰箱中,备用。
  2、先以5000g离心15分钟后,获取上清夜,然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
  3、接着10万g超速离心2h,将沉淀用少量STE溶解。
  4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液,然后在离心管中依次加入30%,45%,60%的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30%与45%以及45%与60%之间都有一条明亮的带,用长针头将两条不同部位的带都吸取出来,分别收集到不同的瓶内。
  5、去蔗糖;用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒,然后11万g离心3h,用少量STE缓冲液把沉淀悬起,即后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用,用时可用分光光度计测定其病毒含量。
 
  密度梯度离心机的注意事项:
  离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面,离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带。再通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带中的颗粒分开收集,得到所需的物质。
  1、梯度介质应具备足够大的溶解度,以形成所需的密度梯度范围。
  2、梯度介质不会与样品中的组分发生反应。
  3、梯度介质也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。
  4、若离心时间过长由于颗粒的扩散作用,会使区带越来越宽。为此,应适当增大离心力、缩短离心时间,可以减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。
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