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贝克曼库尔特|NGS核酸纯化之洗脱篇:用啥洗?加多少?洗多久?加热吗?

点击次数:559 发布时间:2022-05-09

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贝克曼库尔特基于SPRI技术的AMPure XPSPRIselect两种NGS文库纯化和片筛试剂。该技术采用顺磁性的磁珠、选择性的结合特定大小的核酸,被众多主流建库试剂盒及测序专家选用。

那么,金标准"还有优化的空间吗?让原厂来给您专业的分析:单从洗脱,有哪些优化的重点。

 

用什么洗?


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如上图所示Tris or TE buffer (+/-EDTA)中,洗脱得率相比于纯水有了显著提升。而PBS溶液(pH 6-8)的效果紧随其后,且PH无显著影响。这可能与PBS中的盐离子的存在有关。另一方面,从稳定性(CV)上看,Tris\TE\PBS洗脱都优于水。

 

加多少?


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如上图所示:对比了不同加样体积及洗脱体积的影响。所有的DNA起始浓度一致,因此洗脱体积越小,产物相对浓度越高(A);但是由于磁珠也会占用一部分洗脱溶液的体积(约1 µL),产物浓度越高则这部分损失越多(B);虽然小体积洗脱会得到影响核酸的得率,但是这并不是因为洗脱效率引起的:当投入量一致时,不同洗脱体积的得率无显著差异(C)

 

洗多久?加热吗?

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如上图所示:在1分钟的时候,洗脱已经进入平台期(非指数期)提示大多数核酸已经洗脱下来。不加热的情况下,1分钟与20分钟洗脱相比,1分钟的量显著偏低(p < 0.01)。从2分钟洗脱开始,无显著差异。加热至60度后,洗脱速度更快:1分钟与其他时长无显著差异。

 

小结

 

上述实验通过使用lambda phage DNA (49 kb),对贝克曼库尔特的SPRI技术磁珠进行测试,提示:

 

  • 长达49 kb的核酸片段2分钟可以被充分洗脱。

  • 使用Tris溶液可以提升洗脱效率和稳定性。

  • 不同的起始及洗脱体积对洗脱效率影响不大。

  • 但是小体积的物理限制会导致更多核酸损失于死体积。

 


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