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密度梯度离心机在试验中应该如何进行操作?

点击次数:439 发布时间:2019-01-09
  密度梯度离心机技术是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心机技术常用的介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。
 
  密度梯度离心机试验操作过程如下:
 
  1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。
 
  2、先以5000g离心15分钟后,获取上清夜,然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
 
  3、接着10万g超速离心2h,将沉淀用少量STE溶解。
 
  4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液,然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带,用长针头将两条不同部位的带都吸取出来,分别收集到不同的瓶内。
 
  5、去蔗糖;用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒,然后11万g离心3h,用少量STE缓冲液把沉淀悬起,即后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用,用时可用分光光度计测定其病毒含量。

  密度梯度离心机分离活细胞的介质要求:
 
  1、能产生密度梯度,且密度高时,粘度不高。
 
  2、PH中性或易调为中性。
 
  3、浓度大时渗透压不大。
 
  4、对细胞无毒。区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。
 
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