【闯关赢好礼】流式高手挑战赛第一期：样本制备不踩坑！

（具体玩法与规则，请滑至文末查看）

直接洗涤即可，不需消化。

需胰酶/EDTA消化。做凋亡实验时需要用binding buffer wash 1-2遍，洗去残留EDTA。做分选时，单细胞悬液需加入DNase防止聚团。

使用EDTA或肝素抗凝，12h内检测可室温保存，24-48h处理需4℃保存。

取100-200μl抗凝全血/骨髓，加入2ml红细胞裂解液，轻柔混匀，外周血室温孵育裂解10min，骨髓裂解5-8min；特殊样本可增加稀释度或延长裂解时间，加入PBS至满管，300-400g离心5min，弃上清以终止裂解；重复PBS离心洗涤，去除碎片。

骨髓样本粘稠需用PBS稀释后再裂解；若红细胞残留，可重复裂解1次。推荐使用商品化裂解液，不同品牌以具体说明书为准。

在灯光下观察，若样本已呈现透亮状态，说明基本裂解完成。若采用“先裂后染”的流程，建议在透亮后再额外放置约5分钟，以确保裂解更彻底。

胞膜表面染色：根据Panel用量加入5-20μl不同荧光素标记的抗体，避光室温孵育15min，PBS离心洗涤后，重悬于PBS中，若不及时检测，可加多聚甲醛固定后避光4℃保存，待上机检测。

胞内染色：按照不同厂家的说明书，先标记膜表面抗体，再添加破膜剂处理10min，后加入胞内抗体，避光室温孵育30min，洗涤后重悬。

荧光染色过程可以有不同的流程顺序：染色-裂解-洗涤，染色-裂解-免洗，裂解-染色-洗涤。不同的染色流程对流式样本的荧光强度有明显影响，根据多中心数据表明，染色后裂解继而洗涤，可以改善FSC、SSC的CV，得到最高的荧光强度。

新鲜组织样本置于生理盐水或PBS中，室温保存，尽量在12h内处理样本；若无法及时处理，4℃保存，保存时间最好不要超过48h。

剪碎研磨：眼科剪将组织剪成极小块后注射器针芯研磨成匀浆，PBS混匀后，200-300目滤网过滤，离心去上清，PBS洗涤后调整至所需浓度备用。

网搓：剪碎的组织在300目尼龙网上，边搓边PBS冲洗，收集悬液，离心去上清，PBS洗涤后调整至所需浓度备用。

研磨：组织剪成小块放入组织研磨器加PBS研磨至匀浆，加PBS冲洗后收集悬液再过200-300目尼龙网，离心沉淀去上清，PBS洗涤后调整至所需浓度备用。

蛋白酶消化：组织块用PBS漂洗后剪成小块，加入蛋白酶溶液，转至三角烧瓶于37℃水浴或者恒温箱中消化一定时间，每隔5-10min震荡，直至完成消化。消化液经200-300目滤网过滤后离心5min，去上清，PBS洗涤后调整至所需浓度备用。

不同组织样本根据不同检测项目要求需选用不同的处理方法。酶处理注意时间、pH值、浓度等影响，且根据组织类型选择合适的酶。

上皮内淋巴细胞：截取回肠，使用HBSS+FBS+EDTA+DTT+Hepes冲洗，摇床10–15min。

固有层淋巴细胞：使用5% FBS+1.5mg/ml Collagenase VIII+0.1mg/ml DNase in PBS消化30-60min，研磨后用Percoll 40/80%分离。

毛囊干细胞：剃毛取背皮→去脂肪→胰酶消化4℃过夜→37℃ 1h→刮下表皮，过滤。

脐带间充质干细胞：

1. 物理法：剖开脐带，抽掉动脉和静脉，剪成小段，贴壁培养。

2. 消化法：剪碎+胶原酶/透明质酸酶/胰酶/DNase，离心去上清。

四、抗体染色与检测注意事项

离心：必须用平转子离心机，防止细胞损伤。

核内vs胞内染色：根据需求选择透膜剂。

特殊检测（如pSTAT5等磷酸化蛋白）：可能需混搭固定破膜剂。

抗体用量与细胞数关系不大，主要取决于反应体积。

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下一期将于9月上线

高手们，记得准时来战！