离心知识大闯关丨第三期:超速离心转子与耗材的介绍


开学季来啦!
小贝喊你「离心知识大闯关」~
从入门到进阶,三期课堂干货拉满!
每期片尾藏着答题挑战
赢积木、遮阳伞等好礼,速来接招~
(详细活动说明见文末)

第三期
超速离心转子与耗材的介绍
在努力追求良好的样品分离效果时,选择正确合适的离心转子与耗材是非常关键的一步,为什么必须“先选转子、再谈实验"?
转子决定最大RCF、沉降路径、k因子,直接换算成“能不能分离下来、要花多久";
不同转子对梯度完整性、壁效应、剪切力的影响差异可达10倍,一旦选错,后续纯化步骤无法补救;
工业放大路线:小试→定角/水平→中试→连续流→精制→区带,转子选型就是工艺放大的“技术接力棒";
今天的离心课堂将详细介绍不同的离心转子与耗材及其适用场景。
转子是离心机分离样品的核心部件,它的转速与转子的材料及强度有关。转子有四种常见类型,分别是定角转子、水平转子、垂直转子、近垂直转子,此外,利用离心的原理,可以设计出一些其他不同类型的转子,以实现一些特殊的样品分离,主要包括连续流转子、区带转子等。
定角转子
定角转子是所有转子中能实现最快沉淀:把“稀样品"变“浓缩沉淀",且能耐受最高RCF(图1)。在离心过程中,离心管与轴之间的角度是固定的,通常在20°到45°之间。离心时,样品会首先沉淀到离心管侧壁,然后下滑至离心管的外侧底部聚集,形成不对称的沉淀带,这种现象称为壁部效应(图2)。
路径长度、转速和容量保持适当平衡;
沉淀离心时,颗粒沉降速度比水平转子快;
可搭载的离心管尺寸和数量最多,且可选最大容量的离心管。
适用于常规沉淀离心及差速离心,等密度梯度离心,是任务多样化实验室的理想选择。

图1:定角转子及离心示意图

图2:壁部效应,定角转头中的颗粒在沉降时,先沿离心力方向撞向离心管,然后再沿管壁滑向管底。因此,对于某些吸附性较强的颗粒,沉降过程中这些颗粒可能会粘附在管壁
角转子耗材推荐:离心瓶 (Bottle)
离心瓶材质包括聚碳酸酯(PC)和聚丙烯(PP)。离心瓶包含可使瓶子密封的盖子、内塞等盖子组件,盖子有金属盖和塑料盖。通过这样的三件式密封帽组件,实现防漏封闭。离心瓶可以多次回收利用,支持较大体积的样品离心(图3)。


图3:离心瓶
水平转子
为应对使用角转子产生的壁部效应,通常会选用水平转子。在离心过程中,离心管与轴之间的角度从开始0°变成90°,停止时又成为0°。由于其长距离通径,可在无扰动的条件下得到最好的分辨率;可以使用开口离心管,装卸样品量较大。自我平衡修正技术在水平转子上的应用给一些特殊样品的分离带来了方便(如临床上离心采血管)(图4)。
可获得较高纯度;剪切力最低,可很好保护敏感样品完整性;
壁部效应最低,沉降路径最长,最适用于多组分的速率区离心;
也可用于沉淀法,沉淀颗粒集中,有利于小颗粒样品沉降,但缺点为离心效率低(时间长);
速率区带密度梯度离心,差速离心。
蔗糖垫液(sucrose cushion)是沉淀法里“保活"脆弱颗粒的常用缓冲策略。在管底铺一层20–30% (w/v) 蔗糖溶液,样品层在上;离心时颗粒先穿过低黏度样品区,最后“软着陆"在高密度垫层顶部,避免直接撞击管底,既减震又浓缩,还能把大部分杂蛋白挡在上清里。例如,通过在离心管底部铺设4mL 30%蔗糖垫液来替代蔗糖密度梯度离心步骤,同样可以获得完整、均一的外泌体。

图4:水平转子及离心示意图
水平转子耗材推荐:开口管(Open-Top Tube)
薄壁开口管 (Thinwall Open-Top Tube)
材质:聚丙烯材质(PP)/ Ultra-Clear超净材质(PETG);
一次性使用,可穿刺取样;
加样体积:样品应加至距管顶2-3mm左右,以便支撑离心管。
厚壁开口管 (Thickwall Open-Top Tube)
材质:聚丙烯材质(PP)/ 聚碳酸酯(PC);
可回收利用,无法穿刺取样;
加样体积:至少超过1/2离心管体积。

图5:薄壁开口管和厚壁开口管
垂直转子
分离机理与固定转子相似,但与轴之间的角度为0°。密度载量高,样品密度可达1.7g/ml,是最高分辨率的等密度梯度离心选择,两个小时就可以完成质粒DNA的分离(图6)。当样品溶液中存在完全上浮/沉淀的杂质时不推荐使用,也不可用于一般离心沉淀。
离心路径最短,提供最高的等密度梯度离心分辨率。
可用于等密度的质粒DNA的分离、亚细胞器片段的等密度分离、受体和酶的速率区带分离、脂蛋白的等密度分离等。

图6:垂直转子
近垂直转子
其设计基于垂直转子,弥补沉淀回收率的不足,离心管与轴之间的角度小于10°。近垂直转子可承受与垂直转子同样的速度,但可以达到固定转子所能达到的分离样品的纯度。分离较快,而且密度可达1.7g/ml(图7)。
沉淀回收率优于垂直转子;离心效率高于定角转子。
可用于等密度的DNA分离及等密度的脂蛋白分离等。

图7:近垂直转子
(近)垂直转子耗材推荐:
快封管(Thinwall Quick-Seal Tube)
材质:聚丙烯材质(PP)/ Ultra-Clear超净材质(PETG);
一次性使用,可穿刺取样;
手动加热封口。


图8:快封管
一次性使用的快封管在加样后需要使用热封器封口,对于有放射性、致病性或污染性的样品可使用快封管。快封管的材质包括聚丙烯材质(PP)以及超净材质(UC)。
按照顶部结构的不同,快封管可分为圆顶型与钟顶型;按照底部结构的不同分为圆底型与锥底型。需要搭配不同的适配器进行离心(图9)。


图9:快封管
指封管(Thinwall Opti-Seal)
指封管是专为某些转子设计的一次性使用的离心管,有圆顶和钟顶两种类型。指封管配有塑料密封塞,无需使用工具或加热即可方便、快速使用。在离心过程中需要管塞(spacer)来密封管子并支撑管子顶部,放置管塞后可确保指封管密封(图10)。
材质:聚丙烯材质(PP);
一次性使用,盖子可重复, 可穿刺取样。

图10:指封管
四种常见的转子类型在样品的分离纯度和离心效率上各有取舍优劣,大家可根据实验的需要选择最合适的转子(图11)。一般来说,台式离心机和落地高速离心机都以定角转子和水平转子为主,超速离心机上如果涉及一些需要超长离心时间的实验(例如等密度梯度离心),则可选择垂直或近垂直转子来提高实验的效率。

图11:四种常见的转子在样品的分离纯度和离心效率上的比较
除了常规的水平、定角、垂直转子外,连续流转子(continuous-flow rotor)与区带转子(zonal rotor)是两种专为“大体积、连续化、制备级"场景设计的特殊转头。二者结构类似——均为“无离心管"的桶式腔体,并带中央进/出液口,但工作原理与典型应用截然不同,可视为工业级离心应用的两大支柱。
连续流转子
连续流转子的目的是把“低固含量、大体积"料液连续浓缩成“小体积浆"——先澄清、后富集,且无需梯度液。含有颗粒的液体(样品)可以连续地流进正以选定速度运行的转子,颗粒从液流中沉淀下来,而无颗粒的澄清液体流出,实现“边进边出"。壁环积满后停机,人工刮出或反向冲洗收获沉淀。连续流离心是一种省时的实验方法,可在离心力较高的条件下离心,而且不需耗费许多时间灌注或倾倒数目众多的离心管(图12-13)。
省力省时,无需灌注或倾倒离心管;可连续运行2–6 h,相当于6–10 次批次离心,宽泛的温度范围(-20℃–+40℃可调)可保障活性。
每次卸料需停机开盖,半连续而非真正在线。
发酵液澄清(抗生素、酶), 疫苗用菌体/细胞收集,噬菌体、酵母、藻类等“固形物 0.5–5 %"料液快速富集等。

图12:JCF-Z连续流转子

图13:连续流离心示意图
区带转子
区带转子根据样品在密度梯度液中的沉降系数或者密度的不同,可以实现在“超大体积"内做高分辨率密度梯度区带离心——制备纯病毒、亚细胞器、VLP、质粒等。其转子核心组件将转头钵体分为四个部分,当转头在低速运行时,通过一个可拆卸的密封加样组件将梯度液泵入转头,密度较低的梯度液先注入,顺次泵入密度较高的梯度液,形成径向线性梯度。然后加入样品,密封后升速,颗粒会按S值/浮密度径向迁移,形成多个同心圆区带。分离结束后降回低速,泵入置换液,各区带依次被顶出并分段收集。区带转头适用于大体积(约50mL/分钟,或3L/小时)样品密度梯度离心,多数情况下,可使用与水平转头几乎相同的密度梯度离心条件进行分离(图14-15)。


图14:区带转头中的密度梯度液
Ti-15区带转子根据料液固体含量与目标纯度,可先“连续流"富集,再“区带"精分,两级串联已成为疫苗、病毒载体、外泌体工业线的标准配置。
一次可处理500-700mL样品; 无管壁扰动,区带宽度 < 2 mm,回收率 > 90 %。
病毒疫苗纯化(流感、轮状、乙肝、狂犬及百白破等);
亚细胞器(线粒体、微粒体、核糖体)分级;
质粒DNA超螺旋/开环分离(CsCl-EtBr梯度)。

图16:区带离心示意图
最后,对用于不同类型转子中的离心管,我们也列出了建议的加样量,避免离心管在高速旋转中挤压变形,影响实验结果。

对于一些特殊性质的液体,为了防止离心失败和珍贵的样品损失,在实验前应先查询一下离心管/离心瓶材质的耐化学腐蚀性。贝克曼库尔特生命科学离心管的化学耐受性查询可通过“贝克曼库尔特生命科学"官方微信公众号对话栏中的“产品服务——实用查询"功能进行查询(图17)。



图17:贝克曼库尔特生命科学离心管的化学耐受性查询教程
根据查询结果,耐受性为“S"为“satisfactory resistance",表示耐受性较强;“M"为“marginal resistance",表示耐受性一般;“U"为“unsatisfactory resistance",表示不耐受,耐受性较差。
同时,可以登入小贝学习中心()查看转子及耗材操作视频,专题应用讲座等资源(图18)。

图18:小贝学习中心的部分视频资源展示
本次离心知识大闯关系列活动即将告一段落,在这三期的分享中,大家是否掌握了有用的知识?小贝离心课堂今后也会继续推出一些实用离心知识,期待与大家的再次见面!


* 贝克曼库尔特生命科学中国区关于HCP(医疗保健专业人士)品牌提示物的发放,遵循AdvaMed颁布的《与中国医疗卫生专业人士互动交流的道德规范》。请注意,收件地址须为单位地址。


点击至
小贝智选商城

点击至
中文

扫码关注
官方视频号

扫码关注
丹纳赫生命科学

小贝客服热线

扫码至
小贝学习中心
* 版权声明:未经授权,不得对原有的文字图片等内容进行变动、重新编排或者增加新的内容,贝克曼库尔特生命科学保留在不告知前提下随时更新版本的权利。