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如何精|确测定AAV病毒载体空壳率?

点击次数:127 发布时间:2020-10-16

如何精|确测定AAV病毒载体空壳率?

 

重组腺相关病毒(AAV)作为病毒载体,具有安全性好、特异性强、递送效率高等特点,为新的、挽救生命的基因治疗方法带来巨大的希望。但是,虽然电镜等技术可以表征AAV的均一性和聚集状态,但它们没有足够的分辨率来准确定量病毒颗粒的均一性和有效载量。而解决这一问题的方案是:使用分析型超速离心技术(AUC)表征AAV病毒颗粒特性

 

正如基因治疗研究人员所知道的那样,在早期产品开发中有非常多的风险,快速检测产品质量是至关重要的。但到目前为止,使用之前的技术来检测临床级的重组AAV载体仍然是不现实的。

·  qPCR/ELISA、光密度法均为间接检测方法,结果只能用于样品间的对比,而无法准确定量

·  电子显微镜可以在视野中看到空壳颗粒与实心颗粒,但无法确定包含所DNA是否完整,同时也无法定量

·   离子交换色谱法面临分辨率不够、不同血清型病毒颗粒不适用于同一种分析方法等问题

完整的AAV衣壳和相关的衣壳杂质

 

因此,主要的障碍是缺乏高分辨率、可用于定量的技术来监测病毒颗粒产物特性,比如:

·   均一性

·   纯度

·   批次一致性

·   病毒有效载量

使用分析型超速离心技术(AUC)表征AAV病毒颗粒的特性,可以帮助精|准测定AAV病毒载体空壳率!

分析型超速离心技术(Analytical Ultracentrifugation,AUC)是表征生物大分子特性、研究生物分子理化性质的主要技术手段之一,用于分析样品异质性、聚集体的形成以及分子间相互作用等。贝克曼推出的Optima AUC分析型超速离心机由主机、光学系统、转头以及样本池组件等构成,可以想象成是一台制备型超速离心机和光学检测系统的结合,但不同于制备型离心机,Optima AUC作为分析型仪器可以实时监测样品沉降过程中溶质浓度随时间和距离的改变,从而计算得到分子特性。

 

Optima AUC与AAV样品检测结果示意图

 

依据溶液中空壳、实心、中间产物等不同状态病毒载体的沉降系数的不同,AUC分析得到的c(s)分布可以表征AAV病毒载体特性。并且在检测过程中使样品不接触任何基质、不使用任何标准品与标记物,直接检测溶液中AAV病毒颗粒特性。AUC可以帮助研究人员:

ü  定量检测,精|确测定病毒载体有效载量或空壳率。

ü  可以表征生产过程中的产物,帮助确定去除空颗粒的方法。

ü  可以监测AAV载体结构的异质性、聚集状态。

ü  可以区分、量化样品中的多个组分,包括空病毒颗粒、包含全基因组病毒颗粒、包含部分基因组病毒载体、载体碎片、基因组碎片等。

ü  根据不同血清型的AAV载体,对转入基因的大小和单/双链状态进行定量。

 

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