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速率区带离心法 |你的分离纯化方法选对了吗?

点击次数:263 发布时间:2020-10-26

 

 

密度梯度离心(isodensity centrifugation method)又称为区带离心。

该方法的优点是可以同时使样品中几种或全部组分分离,具有良好的分辨率,分离效果好,可一次获得较纯组分。

 

缺点是离心时间较长,需制备梯度液,操作要求高。

 

按照离心分离原理,密度梯度离心又可分为速率区带离心法(rate zonal centrifugation method,R-Z)和等密度离心法  (isopycnic centrifugation method)。

 

速率区带离心也可称为等区密度离心,是根据样品中不同组分粒子所具有的不同的体积大小和不同的沉降系数将混合样品进行离心分离提纯。

 

离心时将需要分离的样品溶液置于由密度梯度材料(如蔗糖、氯化铯 (CsCI)、溴化钠等)形成的梯度液柱上面,样品粒子的密度必须大于梯度液柱中任一点的密度,否则无法得到理想的区带离心效果。离心时,混合样品中不同的组分将在梯度液柱的不同位置分别形成各自的区带,选择适合的转速和时间进行离心,当各组分区带距离拉得远时,结束离心,然后将区带取出。这样只需通过一次离心就可以把混合样品中的各组分分离提纯,其纯度和回收率均可满足要求。

 

优点是一次分离纯化,组分的沉降系数相差 20% 以上的即可选用此法,分辨力高,操作熟练可以将组分沉降系数相差 5%~10% 的样品很好的分离。

 

缺点是材料的条件限制,样品液浓度不能太高,否则操作条件很难控制,同时此法与差速离心法相比,处理样品的量要小的多。


图 1 速率区带离心

 

速率区带离心的时间必须严格控制,不能太短,否则样品区带不清,时间也不能太长,否则待分离组分可能沉底。需要分离的样品颗粒的沉降速度取决于颗粒形状、大小、密度及离心力等因素。离心前后样品的状态如图 1 所示。

 

速率区带离心经典的应用就是通过蔗糖密度梯度离心,进行各种亚细胞器(核糖体、线粒体、Exosome 等)和病毒颗粒(病毒载体、疫苗等)的纯化。例如,我们在上一期中得到的 70S 核糖体沉淀,经过水解后,可利用蔗糖密度梯度离心,进一步分离纯化得到 50S 和 30S 的两个亚基。具体的实验流程如下:

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* 修订日期:2020/10/16

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