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贝克曼库尔特 | 生物反应器可以进行细胞裂解、应激及毒性筛选的测定吗

点击次数:246 发布时间:2022-06-09

 

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微生物反应器的主要功能是模拟微生物生长或生产的自然环境,通过生化反应或微生物自身的代谢获得目标产物。


那么,它可以被用来进行细胞裂解、细胞应激及细胞毒性筛选的测定吗?由于这类实验通常样品量比较大,或者需要离线检测,又或者需要为此重新配置设备,同时人力和实验成本也相当高等等。也许你会觉得不太可能。




但是,贝克曼库尔特的新技术BioLector XT高通量微型生物反应器却可以做到。

 

 

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BioLector XT高通量微型生物反应器

 

它可以同时进行48个样品的平行培养,每个培养体积为微升级别,并可以在线检测各种信号,实现灵活补料和PH调控,且整个过程无需人员值守。因此无需改变任何配置,就既可以满足微生物的高通量培养,又可以进行细胞裂解、应激及毒性筛选的测定。

BioLector进行细胞裂解、应激及毒性筛选的测定:


PI是一种多功能染料,常用于鉴别细胞群中的死细胞,并在多色荧光技术中用作复染剂。它仅能穿透细胞膜破裂的死细胞,嵌入细胞脱氧核糖核酸(DNA)后释放红色荧光,而不能穿透细胞膜完整的活细胞。

 

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BioLector结合 PI 染色法进行细胞裂解、细胞应激及毒性筛选的具体应用。

 

方法


 

大肠杆菌培养:采用 BioLector进行大肠杆菌 Bl21(DE3)菌种培养,培养条件:温度 37° C,振摇速度 800 rpm),微孔板为 BOH2 型 FlowerPlate® 微孔板(MTP),每孔填样体积为800µL。培养基为缓冲液浓度为 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS。


PI 浓度:将 1mM PI 染色液溶于磷酸盐缓冲液中配制 PI 原液。此原液需无菌过滤并在 4° C 下储存。PI 嵌入 DNA 时,为避免对用户造成伤害,培养基中的最终 PI 浓度不应过高。在本应用指南中,培养基最终 PI 浓度应为 5 µM。

 

诱导细胞死亡:在此培养案例中,通过在 7 小时后将培温度提升至 50°C或加入纯甲醇(MeOH)来诱导细胞死亡。

 

测定死亡细胞:诱导细胞死亡后,PI 渗入细胞膜破裂的细胞与 DNA 结合,导致荧光偏移,然后通过PI 滤光片模块检测死亡细胞的荧光信号。

 

结果

 

细胞毒性筛选:采用 BioLector 进行PI 染色和检测进行细胞毒性筛选。添加 MeOH 对大肠杆菌 BL21(DE3)进行应激培养,如下图所示。


 

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不同浓度的MeOH作为应急因素对大肠杆菌培养的细胞毒性筛选

 

培养 7 小时后,添加 27%v/v MeOH 时生长停滞,可通过散射光信号和 DO 信号检测得出:添加 MeOH 后 DO 信号立即增至初始值(100 %),表明细胞开始凋亡。添加 9%v/v MeOH 导致散射光信号减弱,表明生长斜率下降与 DO 信号相呼应。18 小时后,添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的细胞最终 PI 信号分别为 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.。该结果对5µM PI培养基进行了空白扣除。

 

细胞裂解的测定:如图所示,培养 7 小时后,将温度从 37° C 提升至 50°C 以诱导细胞裂解。散射光信号表明,经 5 µM PI 处理的大肠杆菌未进一步生长,热处理 1 小时后对照组也未进一步生长。未经热处理大肠杆菌(+ 5µM PI)的生长曲线显示,细菌在 11 小时前呈指数增长,之后进入稳定期。热处理后大肠杆菌停止生长,2 小时后,细胞开始裂解,因此 PI 信号呈线性增强,并约在培养 14 小时后达到饱和。之所以延迟 2 小时,是因为热量在液体中分布并作用于细胞需要时间。未经热处理组的 PI 曲线在指数生长期可观察到背景荧光信号。


 

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采用BioLector 通过 PI 染色测定细胞裂解


应激细胞测定:在正在进行的培养实验中,散射光和 PI 信号的结合有助于识别应激细胞。在以下案例中,大肠杆菌BL21 分别在两种不同 MOPS 缓冲液浓度的 Wilms-MOPS 培养基中培养。下图表示散射光、DO 信号、pH 值和 PI 信号随培养时间变化的实验结果。更多解析请见应用指南《利用BioLector进行细胞死亡的测定》。

 

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采用 BioLector通过 PI 测量应激细胞

 

从上述应用可以看到贝克曼库尔特 BioLector高通量微生物反应器,不仅可以进行48个样品的高通量发酵,同时在线参数检测、补料和PH调控,从而实现高通量菌种筛选和工艺优化,而且结合 PI 染色法可以进行细胞裂解、细胞应激及毒性筛选的测定。

 

 

 

 

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