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担心PCR扩增的影响?来看自动化PCR-Free解决方案

点击次数:925 更新时间:2023-03-10

常规高通量测序的文库构建,需要PCR扩增。主要是为了对微量DNA样本进行扩增,提高库容;另一方面,放大核酸荧光信号,提高测序准确度。然而,PCR扩增同样也有着无法忽视一些问题:

1.      扩增过程中产生复制错误,累积下去,产生假阳性;

2.      扩增会有一定的偏好性,比如GC含量异常的区域和二级结构等区域,扩增效率低,难以覆盖;

3.      扩增的循环数越多,重复率(Duplication)越高,造成测序成本增加、浪费测序数据。

什么是PCR-Free技术

常规扩增建库有诸多问题,那么PCR-Free技术也就营运而生。PCR-Free技术,相较于常规建库,其建库步骤为:基因组片段化-末端修复-加接头-纯化-文库质控,省去了PCR扩增的步骤。

1.      PCR-Free建库技术:

2.      省去扩增步骤,缩短建库时间;

3.      避免使用高保真聚合酶,降低建库成本;

4.      减少扩增产生的复制错误;

5.      避免扩增偏好性;

6.      避免扩增产生的Duplication,降低测序成本。

llumina DNA PCR-Free PrepTagmentation DNA建库即运用了PCR-free的建库方式,并同时采用创新型链接在磁珠上的转座酶(BLT),将接头连接和DNA 片段化结合到一个简单快速的反应中,实现WGS高度均匀的覆盖。

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针对PCR-Free建库方法,我们推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文库构建自动化方案,该方案可使用低投入量(25-99ng)或标准投入量(100-2000nggDNA进行建库,同时进行96例样本的建库。

·        减少手动操作时间

·        减少系统设置何潜在的移液错误

·        标准化工作流程改进实验结果

·        快速安装

Biomek i7工作站

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1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面

·        集成了96通道移液头与灵活8通道移液头;

·        灵活8通道可配置固定针和可替换吸头通道搭配;

·        96通道可选择上一列、一行、多行等不规则形状排列吸头,实现不定样本数液体转移;

·        斜侧抓板机械手可360度旋转,轻松实现台面全覆盖;

·        多达45个工作板位;

·        可实现震荡、加热/冷却、吸头清洗等功能;

·        开放式工作桌面,可轻松整合外部设备,如(自动PCR仪)。

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2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自动化工作流

使用Biomek i7工作站进行 Illumina PCR free文库构建,轻松解放双手,把更多的活交给工作站来进行

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1.  Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自动化Illumina PCR free流程预估时间(大于100ng gDNA投入)

Method Options Selector (MOS

MOS能够选择样本数量、投入量、Index开始使用位置,以最大限度地提高灵活性、适应性和方法执行的简易性。

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3. Illumina PCR-Free建库方法选项选择器

Guided Labware Setup (GLS)

GLS基于MOS中选择的选项生成的,并提供用户特定的图形设置说明,包括试剂体积计算和准备试剂的分步说明。

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4. 引导式实验室设置提供配方注释,指示试剂量(上图),

并指导用户正确设置平台(下图)

DeckOptixFinal Check (DFC)

在开始运行自动化流程之前,BML中的DFC功能,会通过实时拍照的方式分析工作桌面耗材摆放,以减少设置错误,例如吸头、深孔板摆放位置错误。

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实验设计

为了证明在i7双杂交工作站上进行96个样品文库制备的能力,我们从人细胞系NA12878 gDNA制备文库。将起始浓度为150 ng300 ng400 ng500 ng750 ng48gDNA样本以及阴性模板对照(NTC)随机放入96孔板,如下所示。

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实验结果

·        随机挑取了23 gDNA文库进行测序,平均插入片段为483bp±28bp

·        Reads mapping率为96.8%,标准偏差为0.1%

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Biomek i7工作站上的Illumina  PCR free DNA文库制备自动化是一个独立的解决方案,为任何规模的实验室提供了高效、灵活和可扩展的解决方案。自动化解决方案提供的文库在下游工作流程中产生高质量的结果,并节省了宝贵的时间和金钱。



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