微生物与石油化工，自动化筛选未来可期

硫是原油中含量丰富的元素之一。通过化石燃料燃烧在环境中释放有害的硫氧化物（SO2）会加剧空气污染，在世界范围内造成严重的生态危害问题。燃料中存在的硫酸盐颗粒物也会通过腐蚀降低发动机的寿命。传统化学工艺加氢脱硫（HDS）将化石燃料中的硫转化为污染较小的化合物硫化氢，但需要高温高压，投资巨大、运行成本高，同时二苯并噻吩（DBT）和4,6-二甲基二苯并噻吩（DBT）难以从石油中去除。

生物脱硫（BDS）可在温和的加工条件下降低燃料难熔有机化合物的含硫量，具有更大的成本效益。脱硫细菌可利用DBT及其衍生物中的硫来维持其生长并获得能量，具有“Kodama途径"和“4S途径"2种。Bordoloi NK等人从石油污染土壤中分离出一种新细菌螯合球菌属，可以在多种噻吩化合物中生长，产生2-MBP而不是2-HBP作为最终产品，对细菌的毒性要小得多，同时减少环境污染，具有中温生长条件下柴油燃料生物催化脱硫的潜在应用，并降低BDS过程中能耗。

重质原油的真空渣油馏分是油的粘度大的主要原因。而烷基硫化物桥中C-S键的特异性微生物裂解，在该部分中形成键，可能导致粘度急剧降低。从油污染环境中分离出一种独特的细菌菌株，红球菌属菌株JVH1，它使用双-（3-五氟苯基丙基）-硫化物（PFPS）作为的硫源氧化为亚砜，然后在裂解C-S键之前氧化成砜，形成醇，并可能形成硫酸盐，从中提取硫进行生长。微生物降解重质原油以降低粘度的潜力被认为在微生物增采率（MEOR）中非常有效，早期研究基于三个广泛领域：

嗜热孢子形成细菌可以在油藏中非常不好的条件下繁殖，因此它们是适合提高稠油采收率研究的微生物。通过微生物这种极低的运行成本技术的方法，可以在占世界石油总储量67%的油藏中提取高达50%的残余油。此外，其他的微生物系统也被广泛研究用于实验室和采油现场测试。

烯烃加氢是石油精炼中的一个重要过程，但也存在催化剂中毒、大量传输限制、发热以及与氢气、储存和催化剂等相关的各种障碍。由于这些原因，使用工程微生物在体内进行烯烃加氢已成为能够克服这些障碍的潜在替代方案，此外，随着合成生物学工具和高通量筛选（HTS）技术变得更加经济实惠和容易获得，大肠杆菌或酿酒酵母等微生物越来越多地被用于在工业规模上生物合成具有重要商业意义的氢化烯烃的酶，包括老黄酶、烯酮还原酶和脂肪酸烯酰还原酶。

在耐热嗜酸古生菌中分离出的香叶基香叶酰还原酶（GGR），可以不对称地还原2,3-二-O-香叶基香叶酰甘油磷酸盐中的所有八个异戊二烯基单元，GGR也可以减少由于甲羟戊酸或DXP途径合成的多种基于C15-C20异戊二烯的中间体，GGR在约55℃时表现出最佳活性，因此需要进行大量的酶工程来改善其性能，使其用于大肠杆菌或酿酒酵母等工程微生物菌株以生产各种饱和聚异戊二烯化合物。通过开发新的筛选工作流程，用来确定与工程化GGR蛋白库相关的酶活性和产物形成谱。通过使用Biomek FX液体处理工作站搭配PhyNexus Ni-IMAC tips（20 μL resin bed）对过滤后的细胞裂解液中的GGR进行纯化，随后使用Biomek FX从WebSeal Plate + 96孔玻璃包被孔板中转移酶反应液至384孔板中进行液相萃取。

在检测步骤，使用Echo将环氧化反应产物“打印"涂覆在薄层二氧化硅上，根据环氧化程度进行色谱分离，并与发色团共价连接，从而可以检测具有独特产物分布或增强还原酶活性的酶变体。经过GC-MS验证，这种基于薄层色谱的筛选可以区分选定突变体酶活性的四倍差异。相比于LC/GC-MS复杂的工作流程和分析时间，使用Echo纳升级声波移液系统和薄层色谱搭建的自动化96孔筛选平台极大地提高了检测速度，使并行多个样品检测即时可视化，读值结果更可靠，成为一种高效的筛选流程。

石油中的碳氢化合物成分在活组织中持久、生物积累和生物放大，并对人类健康和生态系统产生有害影响。使用细菌等微生物进行生物增强是一种新兴方法，可以减轻环境来源的毒素。降解碳氢化合物的细菌、藻类、酵母和真菌在海洋、淡水和土壤生态系统中含量丰富。通过连续稀释法，Hussain N等人从受污染加油站土壤中分离石油降解菌蜡样芽孢杆菌，培养72小时时生物量最大，并可去除75%石油，并通过生化表征，确定了该菌存在甲烷、甲基环己烷、甲苯、二甲苯和苯降解途径。相对于传统对总石油烃采取的缓解措施如浮选、超声处理、焚烧、动电修复、微波频率加热、热解吸，以及合成洗涤剂/表面活性剂、土壤冲洗技术和光催化去除组成的物理化学方法，这一生物修复技术更加经济高效环保。

早在2010年，使用大肠杆菌作为生产生物体，葡萄糖作为碳源，从发酵罐的废气中回收异戊二烯并合成橡胶，实现生产生物异戊二烯。与异戊二烯形成聚合物用于生产丁基橡胶的是异丁烯（2-甲级丙烯），后者是许多化学品的关键前体，也可作为燃料，目前通过石化裂解原油大规模生产，但同样在2010年Global Bioenergies公司为其生物基异丁烯发酵生产研究申请了，由于异丁烯在发酵条件下是一种气态化合物，因此很容易从生物反应器中回收，与使用化石原料相比，可再生生物基生产为化学品和燃料的可持续生产提供了有趣的替代方案。

生物异丁烯的形成被证明是由异戊酸脱羧、3-羟基异戊酸酯的脱水和异丁醇脱水催化反应转化形成，负责酶是微粒体细胞色素P450、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶MDD和油酸水合酶等。在细胞色素P450作为NADPH还原酶产生异丁烯的菌株筛选测试时，Fukuda等人从80属的178个测试菌株中总共筛选出33种真菌、31种酵母和6种细菌在有氧条件下产生了微量异丁烯。MDD是一种参与麦角甾醇或低等异戊二烯生物合成的酶，虽然MDD家族存在于多种微生物种，但这些微生物都不会自然产生异丁烯，通过合成方法Bobik等人设计了一种合成方法，将MDD脱羧活性表达到大肠杆菌底盘细胞，通过3-羟基异戊酸盐诱导异丁烯生物合成。异丁醇脱水转化通常使用酸、氧化铝、二氧化硅催化剂和金属盐等在大于100℃下完成，但从假单胞菌属的脑膜败血伊丽莎白金菌中纯化出的油酸水合酶克隆并表达在大肠杆菌中，可对上述催化反应进行生物基生产替代。分子生物学工具和遗传可及性的可用性对于促进菌株开发计划的快速进展至关重要，同时，为了实现菌株高通量构建和筛选、发酵条件的优化，高通量平台的搭建也至关重要。

塑料是石化产品制成的聚合物，为现代社会带来方便的同时，塑料垃圾及塑料污染也极大影响人们的生活。全球每年生产约3.8亿吨塑料垃圾，由于其低自然降解特性，目前处理方式有填埋、焚烧，这将会造成地下水、土壤和空气污染。通过研究发现，昆虫幼虫可以在短时间内消化和降解塑料，采用一种基于氧化还原指标2,6-二氯苯吩多苯酚的新筛选方法，从昆虫幼虫中分离出一种聚乙烯降解细菌——Acinetobacter guillouiae。

塑料的烷烃主链结构可被烷烃单加氧酶羟基化生成醇，醇经醇脱氢酶转化为醛，该醛经醛脱氢酶转化为脂肪酸，然后脂肪酸通过脂质代谢途径降解，蛋白质组学研究表明，当塑料是可用的碳源时，参与烷烃和脂质代谢的酶的表达水平在微生物中会上调。烷烃羟基化和醇脱氢是聚乙烯降解的关键步骤。除此之外，绿铜假单胞菌也是是一种有效的PE降解微生物，可降解如PVC、聚氨酯和聚3-羟基丁酸酯。

常见的一种热性塑料对苯二甲酸乙二醇酯PET所生产的丰富的日常产品中80%以上都是一次性使用，而全球每年2500百万吨每年的PET产品消费量也导致了塑料废物危机。发展新可持续 生物基方法将废碳增值成工业小分子是一种优雅的经济的创建循环化学品方法。通过化学和解聚的生物学方法进行生物升级再造技术，将生活和工业PET中的对苯二甲酸酯废弃物使用大肠杆菌底盘微生物生物转化为工业化学品和尼龙前体己二酸（AA）正在成为可能，同时，由于AA每年的消耗约为260万吨，且多用于材料、药品香水和化妆品行业，因此从可再生原料中生物生产AA方案十分有吸引力。

通过以上内容我们不难发现，微生物在石油化工的各个方面都正在扮演重要角色，极大影响石油化工生产等多方面的效率，同时，也为改善由于泄露等导致的污染问题提供了及其重要的治理角色。

我们不妨可以发散一下思维，在微生物以及合成生物学快速发展的当今，高通量筛选的自动化即将加速微生物在石油化工领域的应用与创新。从生物原件处理、基因编辑菌株构建系统、蛋白表达纯化及表征系统、质谱前处理及代谢产物检测系统和菌种发酵条件优化系统全流程，贝克曼库尔特生命科学具有成熟的经验和落地案例，可帮助加速石油化工菌株筛选、生物转化和生物基生产等过程。