作为一种无菌、可控的生物技术，已成为大规模生产植物源代谢物的重要手段。从基础研究（植物生长和分化研究）到工业化生产（如抗癌药物紫杉醇的生产），植物细胞培养已成为替代传统方法的日益受到关注的成本效益型方案。然而，要实现高效的细胞增殖和产物积累，对培养条件的精确监控至关重要。
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取样焦虑：为了测pH和生物量，不得不中断摇瓶培养，细胞团块让取样更加困难。
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数据盲区：传统离线检测只能看到“快照”，错过关键代谢时间窗。
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细胞团块难题：植物细胞易形成聚集体，传统方法难以准确衡量细胞大小和聚集状态。
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通量瓶颈：想优化培养条件？48个条件要摇多少瓶子、熬多少个夜？
本文将介绍如何运用BioLector XT微型生物反应器和Multisizer 4e库尔特计数器，实现植物细胞培养条件的优化和细胞生长的精准表征，让工艺开发周期从“按月算”变成“按天算”！
BioLector XT是一款小型化、自动化的微型生物反应器系统，能够实现高通量筛选、培养参数实时监测（如pH、生物量、溶氧饱和度、振荡速度及荧光强度）以及补料策略优化。尤为重要的是，上述所有参数的监测均可在不间断振荡、无需取样的条件下在线完成。
本研究以表达绿色荧光蛋白（GFP）的烟草BY-2转基因细胞系（Nicotiana tabacum BY-2）为实验对象，在BioLector XT的48孔微孔板中进行培养。
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预培养条件为：将20 mL培养7天的种子液接种至含180 mL新鲜培养基（pH 5.8）和100 mg硫酸卡那霉素的250 mL摇瓶中，于20 °C、190 rpm（振幅50 mm）条件下振荡培养。
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培养基配方：4.4 g/L MSMO基础盐（含微量有机物）、0.2 g/L磷酸二氢钾、0.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.6 mg/L硫胺素及30 g/L碳源。主培养在BioLector XT中进行，振荡频率1000 rpm（振幅3 mm），温度26 °C。
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实验分为两部分：实验1验证BioLector XT的监测能力，对5个独立孔进行接种，接种量10%（v/v），在线监测散射光（生物量）、GFP荧光、NAD（P）H荧光、pH及溶氧（DO）；实验2考察不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖，浓度均为30 g/L）和接种量（5%或10% v/v）对细胞生长的影响。
实验1的结果如图2所示。散射光信号估算的生物量呈现典型的指数增长曲线（图2A）。约110小时处观察到的信号下降并非由生物量降低引起，而是由于碳源耗尽后细胞形态由圆形变为伸长形，导致散射光特性发生改变——这是植物细胞悬浮培养的典型特征。与此一致，与生长相关的GFP表达也呈现指数增长趋势（图2B）。NAD（P）H信号在细胞代谢稳定期间与生物量浓度高度相关（图2C）。
在线监测同时显示，pH在前24小时内降至最低值5.0，随后缓慢回升至最高值6.5（推测与培养基中氮化合物的代谢有关）（图2D）；溶氧值则缓慢下降至最低约85%（图2E）。所有五个孔在各参数上均表现出良好的一致性。
图2：展示了植物细胞培养的在线监测可重复性数据，包括：(A) 散射光信号（生物量）；(B) GFP荧光信号；(C) NAD (P) H信号；(D) pH变化曲线；(E) 溶氧（DO）变化曲线。五个独立孔的数据高度一致，证明了BioLector XT监测系统的可靠性与稳定性。
实验2重点评估了碳源类型和接种量对培养效果的影响，结果如图3所示。令人意外的是，不同碳源类型及接种量条件下，培养终点的生物量浓度（散射光或NAD (P) H信号）并无显著差异（图3A和图3C）。但生长速率存在明显不同：以10%（v/v）蔗糖为碳源时生长速率最快，约100小时即达到最大生物量；而以5%（v/v）葡萄糖为碳源时生长最慢，达到最大生物量需约190小时。GFP荧光信号的变化趋势与此一致（图3B）。
图3：展示了不同碳源和接种量对植物细胞培养的影响：(A) 散射光信号（生物量）随时间变化曲线；(B) GFP荧光信号曲线；(C) NAD (P) H信号曲线。结果表明，蔗糖作为碳源配合 10% 接种量可获得最快的生长速率，而各组最终生物量趋于一致。
这些结果表明，BioLector XT可有效用于优化植物细胞培养条件。持续振荡测量确保了良好的传质和细胞悬浮均一性；散射光测量适用于植物悬浮培养中的异质性大细胞聚集体；系统支持单次运行多达48个批次的高通量筛选，为培养条件评估、工艺开发和规模放大提供了强有力的工具。
细胞尺寸是洞察多种细胞机制的关键参数，包括细胞周期、渗透调节、细胞死亡、病原体侵染、吞噬作用及物种多样性等。Multisizer 4e库尔特计数器基于库尔特原理，可检测200 nm至1,600 μm范围内的颗粒，不受颗粒性质或光学特性的影响，是植物细胞尺寸和聚集体分析的理想工具。
待测样品悬浮于0.9%电解质溶液中，通过一个小孔管（aperture）被吸入。孔管两侧各有一个浸没电极，形成恒定电流。当每个颗粒通过孔管时，会瞬时置换与其自身体积相等的导电液体，导致孔管阻抗瞬时增加，产生一个与颗粒体积成正比的电压脉冲。脉冲数量对应颗粒数量，脉冲幅度对应颗粒体积。该技术使研究人员能够精确测定样品的体积、数量和浓度，并实时检测尺寸变化——这对检测植物细胞培养中常见的细胞聚集体尤为重要。
取植物细胞培养样品，以Isoton 2稀释液按1:200预稀释于400 mL烧杯中。从该稀释液中取500 μL进行测量。测量采用1000 μm孔管，单次测量时间120秒。主要仪器设置参数见表1。所得数据通过数字脉冲处理（DPP）技术进行分析，该技术可实现每个独立脉冲的采集、存储和显示，支持在后续分析中对脉冲谱的特定区域进行单独评估。
如图4的DPP数据所示，该培养体系中植物细胞的尺寸分布在30至320 μm范围内。DPP技术以脉冲高度对脉冲宽度的散点图形式呈现原始数据，图中虚线标注了用于进一步分析的数据选取范围。
图4：展示了Multisizer 4e的数字脉冲处理（DPP）原始数据。以脉冲宽度对脉冲高度的散点图形式呈现，虚线标示了用于后续分析的数据筛选范围。该技术提供了超高的分辨率，可检测样本中单个颗粒级别的变化。
从DPP原始数据中，研究人员可以选择特定尺寸区间（如图4虚线所示的范围）并生成频率分布直方图。例如，图5展示了选取40-140 μm尺寸区间后得到的细胞直径分布直方图，清晰呈现了细胞群体的尺寸分布特征。
图5：展示了选取40-140 μm尺寸区间后得到的植物细胞直径分布直方图。该数据可用于研究细胞尺寸随时间的变化规律，表征细胞聚集体的形成过程，以及比较不同培养条件下的细胞状态。
这类数据具有广泛的分析应用价值。例如，通过对不同时间点采集的样品进行比较分析，可研究细胞尺寸的动态变化规律，帮助表征细胞聚集体的形成过程。此外，比较不同环境条件下获得的细胞尺寸数据，有助于进一步优化细胞培养工艺。Multisizer 4e的DPP技术提供了超高分辨率与精度（可检测1 mL样品中的单个颗粒），这是其他技术难以企及的独特优势。
BioLector XT微型生物反应器与Multisizer 4e库尔特计数器作为两款台式设备，凭借直观的用户界面，可轻松融入任何实验室工作流程，为植物细胞培养工艺的优化与监测提供端到端的解决方案。
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通量：24或32孔FlowerPlate (R) 微孔板，工作体积0.8-2.4 mL
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监测参数：生物量（光密度）、pH、溶氧（DO）、荧光强度（GFP/RFP等）、震荡转速
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微流控功能：支持pH精确控制与补料策略（Fed-Batch）
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软件：直观可视化界面，实时生成生长曲线与产物表达动力学
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检测原理：库尔特原理（电阻法），基于颗粒体积进行计数和sizing
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孔径选择：20 μm-2,000 μm多种孔径管，覆盖细菌到大型细胞团
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核心技术：Digital Pulse Processing（DPP），支持原始脉冲数据回溯分析
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分辨率：400个粒径通道，可检测1颗粒/mL的稀浓度样品
植物细胞培养工艺开发的“快准狠”时代已经到来！无论是植物天然产物的高通量筛选，还是生物制药的工艺表征，这套组合都能为你加速获得答案。
