从470万候选中发现高效蛋白酶底物：流式筛选赋能前药开发
Cell Reports Methods研究展示高通量
流式筛选在条件激活疗法中的应用价值
这一挑战的核心，在于如何提升药物的组织选择性，在保证疗效的同时减少因正常组织表达相同靶点而产生的靶向正常组织毒性（On-target, Off-tumor Toxicity）。近年来，利用肿瘤微环境特征实现药物条件激活，逐渐成为创新药研究的重要方向。
其中，Protease-Activated Prodrug（蛋白酶激活前药）被认为是极具潜力的解决方案之一。其设计理念类似于给药物戴上一层“面罩”：药物在正常组织中保持低活性状态，当进入肿瘤微环境后，由局部高表达蛋白酶切除遮蔽结构（Masking Domain），从而恢复药物活性。
图1｜抗体前药的Matriptase响应性激活原理。Matriptase切割抗体与遮蔽结构之间的底物序列，使遮蔽结构从抗体上移除。图片来自原文Figure 6A。
对于ADC、Masked Antibody以及Probody等新一代精准疗法而言，药物能否被快速、选择性地激活，很大程度上取决于连接结构中的蛋白酶底物设计。
肿瘤微环境中存在多种可用于激活前药的蛋白酶，例如Matriptase、MMP家族、Cathepsin家族以及uPA等。然而，在实际药物开发过程中，研究难点往往不在于找到蛋白酶，而在于找到能够被目标蛋白酶高效、快速且特异识别的底物序列。如果底物切割效率不足，即便药物能够到达肿瘤组织，也可能出现激活速度慢、激活程度不足等问题，进而影响最终疗效。
近期发表于Cell Reports Methods的一项研究将目光聚焦于Matriptase。该蛋白酶在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及前列腺癌等多种肿瘤中表达升高，因此被认为是具有应用前景的前药激活靶点。
为了寻找更优的Matriptase底物，研究团队设计了一个理论容量达到470万种变体的组合肽库。如此庞大的候选空间显然无法通过传统逐个验证的方法完成筛选。为此，研究团队构建了一套基于E. coli Display（大肠杆菌表面展示）的高通量筛选平台。
在这一系统中，每个细菌表面展示一种候选底物。研究人员将底物置于两个报告模块之间：
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表达报告信号（Expression Reporter）
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切割报告信号（Cleavage Reporter）
当Matriptase切开底物后，切割报告信号降低或消失，而表达报告信号仍然保留。这样，原本发生在分子层面的酶切事件便被转化为可直接测量的流式信号。
图2｜E. coli表面展示与流式检测原理。底物未被切割时，细胞同时保留表达报告信号和切割报告信号；底物被Matriptase切割后，切割报告模块从细胞表面脱离，而表达报告信号保留。流式细胞术据此识别并分选可切割底物。图片来自原文Figure 1C和Figure 1D。
在筛选过程中，研究团队采用CytoFLEX S流式细胞仪进行流式分析，并利用CytoFLEX SRT流式细胞分选仪完成荧光激活细胞分选。
整个文库共进行了4轮筛选，并随着筛选推进逐步降低Matriptase浓度，从而不断提高筛选压力。结果显示，可被Matriptase切割的候选底物逐轮富集。
图3｜连续4轮FACS分选后，可被Matriptase切割的底物逐步富集。横轴为表达报告信号，纵轴为切割报告信号；右下目标区域中的细胞保留表达报告信号，但切割报告信号降低。随着分选轮次增加，目标区域中的细胞群体持续富集。图片引自原文Figure 2A。
这一结果表明，该平台能够在百万级候选空间中快速识别和富集目标底物，为后续优化提供高质量候选来源。
流式细胞术在这项研究中的价值不仅体现在富集候选，更体现在对候选性能的快速比较和排序。研究团队从筛选结果中随机挑选192个克隆，通过流式细胞术逐一评估其切割表现，从而筛选出表现最优的一组候选。最终，研究团队从192个候选中筛选出7个代表性底物进入后续验证，其中MtpC5、MtpC9和MtpB9表现最为突出。
随后，研究团队进一步利用流式细胞术分析这些候选在不同Matriptase浓度下的切割动力学表现。
图4｜基于E. coli表面展示和流式细胞术测得的候选底物相对切割动力学。在1 nM Matriptase条件下，MtpB9、MtpC5和MtpC9经90分钟处理后均有超过50%的展示底物被切割；在10 nM Matriptase条件下，这3个候选均可在60分钟内实现完全切割。数据来自2次重复实验。图片引自原文Figure 3。
这些结果说明，流式筛选获得的候选不仅能够被切割，而且在低酶浓度条件下仍然保持优异的切割效率。
更重要的是，基于E. coli表面展示和流式细胞术获得的候选相对排序，与后续FRET动力学分析结果总体一致。这种一致性验证了该高通量方法在底物发现及相对切割效率评估中的可靠性。不过，由于E. coli表面展示系统无法精确控制底物浓度，因此其优势主要体现在候选的相对比较与排序，而完整动力学参数仍需借助FRET等后续方法完成测定。
与传统逐个验证底物的方法相比，研究团队构建的E. coli Display系统赋予每个细菌多个底物拷贝，并结合流式细胞术实现单细胞水平分析。
这不仅能够识别底物是否被切割，还能够根据切割程度对不同候选进行排序（Ranking），从而在大规模候选库中快速锁定表现更优的底物序列。
对于蛋白工程、抗体工程以及创新药研发而言，这种“筛选+排序”的能力显著提升了候选发现效率，也为后续功能验证提供了更加可靠的依据。
为了进一步验证筛选结果，研究团队采用FRET动力学实验对最优候选进行精确定量分析。结果显示，表现最佳的MtpC5底物催化效率（kcat/KM）达到5.13×10⁵ M⁻¹·s⁻¹；相比参考底物Mtp-control的1.28×10⁴ M⁻¹·s⁻¹，实现约40倍提升。
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470万候选底物文库
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4轮流式分选富集
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最佳候选活性提升40倍
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低浓度Matriptase即可高效切割
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流式筛选结果与动力学验证高度一致
对于药物研发而言，优秀的体外筛选结果只是第一步。真正重要的是，这些通过流式筛选获得的候选底物能否在实际药物构建中发挥作用。
为此，研究团队进一步将MtpC5、MtpC9和MtpB9整合至抗体前药模型中，并通过SDS-PAGE及条带灰度分析评估底物切割情况。结果显示，在1 nM Matriptase条件下处理30分钟后，3个候选已出现24.3%至34.6%的部分切割；当Matriptase浓度提高至10 nM时，3个候选均可在30分钟内实现完全切割，而参考底物Mtp-control在相同条件下未观察到可检测的切割。上述结果从结构层面证明，新底物能够促进遮蔽结构的高效移除，支持其在Matriptase响应型抗体前药中的进一步开发潜力。
图5｜候选底物在抗体前药模型中的切割验证。左图为10 nM Matriptase处理30分钟后的代表性SDS-PAGE结果，其中MtpC9作为新底物示例；右图为MtpC5、MtpC9和MtpB9在不同Matriptase浓度和处理时间下的切割百分比。结果显示，3个候选在10 nM Matriptase条件下处理30分钟均可实现完全切割，而参考底物Mtp-control在相同条件下未观察到可检测的切割。图片引自原文Figure 6B和Figure 6C。
这一结果表明，通过流式筛选获得的候选底物不仅在E. coli表面展示体系中表现出优异的切割效率，在抗体前药模型中同样能够实现快速且高效的蛋白酶响应性切割，为后续条件激活型药物开发提供了有价值的候选序列。
长期以来，流式细胞术被广泛应用于免疫表型分析、细胞功能研究以及细胞治疗开发等领域。而这项研究展示了流式技术在蛋白工程与药物发现领域的另一种价值。通过将蛋白酶切割事件转化为单细胞水平的可量化信号，并结合高通量分析与分选能力，研究团队成功从470万个候选序列中筛选出高性能底物，为下一代条件激活疗法开发提供了新的技术路径。
对于ADC、Probody、Masked Antibody以及未来更多条件激活型创新疗法而言，高通量流式技术不仅能够帮助研究人员发现候选分子，更能够在早期研发阶段实现快速筛选、性能比较和候选排序，从而加速创新药开发进程。
从细胞分析到分子发现，流式细胞术正在不断拓展其在创新药研发中的价值边界。
参考文献：
Mestre Borras A, Mehari H, Ståhl S, Löfblom J. Engineering high-efficiency matriptase substrates using E. coli display for applications in prodrug activation. Cell Reports Methods, 2025.
