【超速“密”籍】载药越多，药效越好？超速离心揭开mRNA‑LNP隐藏属性
mRNA-LNP药物是以脂质纳米颗粒（LNP）为递送载体，包裹信使RNA（mRNA）的一类核酸药物，可利用宿主细胞核糖体翻译出目标蛋白发挥药效，不会整合入基因组。该技术平台开发速度快，可应用于传染病疫苗、蛋白替代、罕见病治疗，当下热点的个性化黑色素瘤新抗原疫苗Intismeran Autogene（原名mRNA-4157/V940），就是默沙东与Moderna合作基于该技术开发的候选药物。
原理：
mRNA‑LNP制备属于随机融合自组装，同一批次产物内部mRNA拷贝数呈随机分布，存在空载、低载量、高载量LNP亚群。mRNA密度（~1.6 g/cm³）远高于脂质（0.8‑1.1 g/cm³），因此mRNA‑LNP的密度由mRNA载量决定，载量越大，密度越大。可利用超速离心，基于密度差异实现不同载药量LNP的分馏。
结果1：
通过密度梯度离心可以区分LNP内部mRNA装载拷贝数，粒径大小则不能
密度梯度离心后（左图），样品上部为低密度组分（LDLNP），下部为高密度组分（ HDLNP）。两个组分与原始溶液相比，其粒径没有本质性的区别（中图，DLS检测），但是其mRNA的拷贝数存在明显的差异性（右图，mRNA/脂质比值）。
超速离心不破坏LNP结构、不降解mRNA
iboGreen检测显示LDLNP和HDLNP的包封率与原始样品没有区别（超过98%，左上图），毛细管电泳则显示mRNA的完整性未受影响（右上图）。但是，不同包封率的LNP，其形态上发生了显著的变化（下图，电镜）。
装载高拷贝数mRNA的LNP，表达效果反而更低
体外细胞实验表明：mRNA的摄取水平（Cy5通道）没有本质性的区别，但是OLNP和LDLNP比HDLNP更多的蛋白表达（EGFP通道）。
体内功能实验表明（A），静脉注射后3小时，小动物活体成像的结果揭示，HDLNP的表达量比对照高很多，但是相比OLNP/LDLNP组低了20倍（B）；肝脏和脾脏生物发光图像结果同样符合这个趋势（C）。
知识点：mRNA‑LNP
密度梯度实验流程
步骤一：梯度制备
配置蔗糖连续线性密度梯度，LNP实验常用5%-10（25）% w/v蔗糖梯度，可搭配NaCl反向梯度维持渗透压，减少纳米颗粒渗透压应激损伤，避免扰动。
步骤二：样品上样
将LNP样品非常轻柔地平铺叠加在梯度介质的最上层，操作动作要平缓，经量不要破坏下层已经成型的蔗糖梯度液。样品体积不要过多。
步骤三：离心分离
将装好样品的离心管装入水平转头，放入超速离心机中进行离心。具体转速、时间需要根据目标LNP粒径做方法优化。离心过程中，LNP根据密度的差异性，迁移到和它密度相等的蔗糖梯度液处。
步骤四：组分收集（分馏）
离心结束，把梯度液从顶部到底部分成若干独立组分，对整根梯度液进行分层收集，每一层对应一组特定密度的LNP亚群。
步骤五：分析检测
收集得到的各个组分，可以从粒径分布、包封效率、核酸载量、体外转染活性不同亚群的LNP的异质性，用于配方评估与工艺优化。
值得注意的是，密度梯度离心把LNP按载量“分开”之后，如何逐一确认每个亚群里“颗粒到底装没装、粒径是否均一”，就需要一个能在单颗粒层面表征的正交手段。传统DLS/NTA只能给出群体平均值，难以分辨亚群差异；而纳米流式（CytoFLEX nano）可覆盖40nm–1µm，在单颗粒水平同时读取散射与荧光，与超速离心形成“分离+表征”的完整闭环。
这项技术还能解决什么问题
指导LNP脂质组分筛选与制剂开发2-3
指导LNP存储条件优化2
参考文献：
1.Transfection Potency of Lipid Nanoparticles Containing mRNA Depends on Relative Loading Levels.
2.Analytical Characterization of Heterogeneities in mRNA-Lipid Nanoparticles Using Sucrose Density Gradient Ultracentrifugation.
3.Surface charge of LNP and V-ATPase activity of target cell synergize in functional delivery of nucleic acid in vitro and in vivo.
