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离心知识大闯关 | 第二期：离心方法介绍

点击次数：13 更新时间：2025-09-11

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第二期

离心方法介绍

常用的离心方法及其离心原理

在实验过程中，由于实验目的不同和样品的各种性质差异，只有选择了正确的离心方法，才能获得预期的分离纯化结果。今天的离心课堂将为大家介绍几种常用的离心方法并阐述其离心原理，帮助大家日后更好地理解并应用。

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解锁离心相关小知识～

利用样品中各组分沉降系数的差异，对不同的微粒施以不同的离心力，经过多次离心，离心速度逐步加大，将不同的微粒依次沉降，从而实现离心分离。以不同的离心力分离不同粒径的微粒是动力学的分离方法。

如果分离样品中有大中小三种不同粒径的微粒，对它们施以不同的离心力，大粒径的微粒，其质量较大，首先沉降。分离上清液，以更大转速对上清液进行第二次离心，中颗粒被分离出来。再取上清以更大离心力，更高的转速，最后沉降小颗粒，以达到不同颗粒的分离，如图1所示。由于在每种颗粒的沉淀物中总含有部分次级颗粒，如想将某种颗粒提纯，需对该颗粒的沉淀物进行稀释后再离心沉淀，最终可制备出理想纯度的颗粒。

图1：差速离心

差速离心主要用于分离直径和密度差异较大的颗粒和大量样品的初步分离提纯。

优点：

分离时间短、重复性高，样品处理量大

缺点：

分离复杂样品和要求分离纯度较高时，离心次数多，操作繁杂。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中间损失，所以离心分辨力差。

实际分离时由于离心时的对流、扩散和收取沉淀时的污染，对于一些沉降系数相差不大的组分无法进行完全的分离提纯，样品的纯度和回收率都不理想。

案例

以动物肝组织匀浆液为例，对匀浆液进行多次的不同相对离心力和时间的离心和沉淀/上清分步收集，就可以得到样品的细胞核、线粒体、溶酶体和核糖体等的初步分离富集沉淀，用于下一步的其他检测或者精细纯化实验。具体处理流程如图2所示。

图2：通过差速离心对动物肝组织匀浆液进行多次分离，得到不同样品

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定义：密度梯度离心是一种借助离心力和液体密度梯度，将颗粒按密度差异进行分离和纯化的技术。通过制备自上而下递增的密度梯度液柱，并在顶部加载样品，离心时不同密度的颗粒会在与其自身密度相等的液层处形成条带，从而得以分离。

优点：

可以同时使样品中几种或全部组分分离，具有良好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯组分。

缺点：

缺点：离心时间较长，需制备梯度液，操作要求高。

按照离心分离原理，密度梯度离心又可分为速率区带离心和等密度梯度离心。

速率区带离心（Rate zonal centrifugation）

根据样品中不同组分粒子所具有的不同的体积大小和不同的沉降系数，将混合样品进行离心分离提纯。离心时将需要分离的样品溶液置于由密度梯度材料，如蔗糖等形成的梯度液柱上面，且样品粒子的密度必须大于梯度液柱中任一点的密度，否则得不到理想的区带离心效果。离心时，混合样品中不同的组分将在梯度液柱的不同位置分别形成各自的区带，选择适合的转速和时间进行离心，当各组分区带距离拉得最远时，结束离心，然后将区带取出（图3）。这样只需通过一次离心就可以把混合样品中的各组分分离提纯，其纯度和回收率均可满足要求。

图3：速率区带离心

工作原理：

制备密度梯度：将密度较低（轻）的缓冲液置于离心管顶部，下方依次叠加密度递增的缓冲液，形成连续或不连续的密度梯度。

加样：把含有目标颗粒的样品轻轻铺加于梯度液柱顶部。

离心：在高速离心力作用下，颗粒沿离心力方向沉降。

收集：停止离心后，通过穿刺、吸液或冷冻切割管壁等方法，按层收集不同条带中的颗粒。

优点：

通过一次分离纯化，组分的沉降系数相差20%以上的即可选用此法，分辨力高，操作熟练可以将组分沉降系数相差5%～10%的样品很好的分离。

缺点：

材料的条件限制，样品液浓度不能太高，否则操作条件很难控制，同时此法与差速离心法相比，处理样品的量要小的多。

要点：

速率区带离心的时间必须严格控制。时间不能太短，否则样品区带不清；也不能太长，否则待分离组分可能沉底。需要分离的样品颗粒的沉降速度取决于颗粒形状、大小、密度及离心力等因素。

案例

其最经典的应用就是通过蔗糖密度梯度离心，进行各种亚细胞器（核糖体、线粒体、Exosome等）和病毒颗粒（病毒载体、疫苗等）的纯化。以70S核糖体沉淀为例，经过水解后，可利用蔗糖密度梯度离心，进一步分离纯化得到50S和30S的两个亚基。具体的实验流程如图4所示。

图4：以70S的核糖体为例，水解后可通过蔗糖密度梯度离心，进一步分离纯化得到50S和30S的两个亚基

等密度梯度离心 (isopycnic centrifugation)

等密度梯度离心是根据样品中各组分的浮力密度差不同进行分离。在离心力场中，溶液中颗粒浮力密度小则上浮，浮力密度大则下沉，上浮和下沉的颗粒会一直延梯度液移动到与其浮力密度恰好相等的位置上，该位置也称颗粒的等密度点。

σ>ρ时，v>0即样品顺离心力方向沉降
σ<ρ时，v<0即样品逆离心力方向上浮
σ=ρ时，v=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置

工作原理

制备密度梯度和加样：

a) 等密度平衡区带（Equilibrium Zonal）：将密度较低（轻）的缓冲液置于离心管顶部，下方依次叠加密度递增的缓冲液，形成不连续的密度梯度。把含有目标颗粒的样品轻轻铺加于梯度液柱顶部。

b) 等密度梯度（Isopycnic）：将自形成连续密度梯度液与样品直接混合

离心：在高速离心力作用下，颗粒沿管长方向沉降或上浮，直至达到与其密度相同的液层（等密度点）。

收集：停止离心后，通过穿刺管底、吸液或冷冻切割管壁等方法，按层收集不同密度条带中的颗粒。

等密度梯度离心前后样品的状态如图5所示。因此，在离心前，样品可置于梯度液的任意位置，一般是均匀分布在梯度液中。

图5：等密度梯度离心

要点：

离心时样品各组分颗粒将按其密度大小分别移至等密度点形成区带，形成的区带不会因离心时间长而发生变化。离心后收集所需区带颗粒即为纯化组分。等密度梯度离心法的离心效果取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越显著，与样品颗粒的大小与形状无关。

等密度梯度离心经常使用的梯度液包括氯化铯(CsCI)、溴化钠等，典型的应用包括质粒 DNA（或者其他DNA、RNA核酸片段）的大规模高纯度纯化，脂蛋白的分离纯化等（图6-7）。

图6：质粒DNA的氯化铯等密度梯度离心分离纯化流程

图7：脂蛋白溴化钠等密度梯度离心分离纯化流程

梯度介质

在密度梯度离心操作中，梯度介质的铺设是决定分离精度的核心步骤。

常用介质必须具备以下特性以确保样品完整性与实验重现性：

足够高的溶解度，可形成所需密度
低黏度，利于快速沉降
化学惰性或低生物毒性，不损伤生物活性
易于去除或不影响下游实验

根据目标颗粒的沉降系数或浮力密度，可参考下图（图9）选用合适介质铺设连续梯度液或不连续梯度液。连续梯度液密度变化是平滑连续的，不连续梯度液密度是分层的、呈阶梯式变化（图10）。因此，连续梯度用于精细分离大小相近的颗粒（如不同构象的DNA），分辨率取决于斜率；不连续梯度更像筛子，先快速分层，再在阶梯界面处“把关”，常用于先粗分、后回收，兼顾速度与通量。