贝克曼库尔特（Beckman Coulter）助力mRNA疫苗研发与抗体评价自动化

mRNA疫苗研发涉及高通量构建、功能性抗体评价以及抗药抗体（ADA）检测等多个关键环节。围绕这些流程节点，自动化液体处理、检测平台整合和动态排程已成为提升实验通量、标准化程度和流程一致性的重要技术路径。

在相关研究与方法开发中，贝克曼库尔特（Beckman Coulter）生命科学的自动化平台被应用于mRNA疫苗研发与抗体评价流程，包括基于Echo 525声波移液系统的高通量构建流程，基于Biomek液体处理工作站、Echo 650声波移液系统等平台的假病毒中和试验、多重抗体结合分析及桥接ELISA自动化流程。

这些平台主要用于样本稀释、加样、反应体系构建、洗板、数据读出衔接及排程执行等实验环节。中和活性、抗体结合水平与ADA检测结果仍取决于样本特征、生物体系、试验设计及数据分析方法。

一、mRNA疫苗研发中的自动化需求

自20世纪60年代发现mRNA以来，研究者持续探索其作为治疗性药物和蛋白递送手段的应用可能。近年来，随着mRNA稳定性改进和递送方法的发展，mRNA相关研发不断推进。与此相对应，实验室自动化液体处理在研发流程中的应用也逐步扩展，覆盖构建、筛选、功能评价和免疫原性分析等多个阶段。

在mRNA疫苗开发过程中，中和试验通常被用于临床前阶段的功能性评价，以评估疫苗诱导抗体是否能够阻断病毒感染，并比较不同设计或剂量方案下的免疫效果。常见形式包括假病毒中和试验和活病毒中和试验。其中，假病毒中和试验因具备较好的安全性、规模化适配性和自动化兼容性，在mRNA疫苗评价中应用较为广泛。

二、高通量构建阶段的自动化流程

在mRNA疫苗研发前期，自动化克隆流程可用于Golden Gate构建体组装及冠状病毒刺突变体克隆的自动化实施。相关流程中使用了：

·       Echo 525声波移液系统

·       QPix 420克隆挑选系统

这一流程的核心作用在于支持高通量液体处理与克隆筛选执行，从而提升构建阶段的流程效率与标准化水平。该类平台在此阶段承担的是实验执行与流程自动化支持功能，不直接构成后续免疫学评价结果的决定因素。

三、基于荧光素酶化学发光法的假病毒中和试验自动化

SARS-CoV-2慢病毒假型中和试验可在由以下模块组成的整合自动化平台上完成：

·       Biomek液体处理工作站

·       常温耗材存储系统

·       37℃恒温培养箱

·       MD Paradigm多功能酶标仪

自动化检测流程由SAMI EX软件进行排程和控制。

第1天：样品稀释与病毒孵育

样品以1:20为起始稀释倍数，在D10培养基中进行连续四倍稀释七次。D10培养基成分为：

·       10% FBS

·       DMEM

·       0.3 μL/mL嘌呤霉素

所有操作均在无菌聚丙烯384孔深孔板中完成。

稀释后的样品从批量稀释板转移至单个384孔黑色培养板，每孔加样30 μL。随后，将SARS-CoV-2 S假型病毒以D10稀释液稀释后，以每孔30 μL的体积加入含梯度稀释样品的细胞培养板中，并在37℃、5% CO₂条件下孵育45分钟。

加入报告细胞与培养

在上述孵育步骤后，向病毒/样品处理后的培养板中加入293T人源ACE2报告细胞，每孔接种10,000个细胞，加入总体积为20 μL。之后继续在37℃、5% CO₂条件下孵育72小时。

第4天：发光检测与中和分析

自第1天起72小时后，从各孔中取出50 μL培养基，加入30 μL荧光素酶底物，于室温静置2分钟后，使用Paradigm多功能酶标仪测定相对发光单位（RLU）。

中和百分率计算基于待测孔、病毒对照孔及细胞对照孔的RLU归一化结果完成。中和曲线拟合采用LabKey基于Web的服务器上的NAB分析模块，使用五参数非线性回归方法进行分析。中和抗体滴度以使RLU降低50%所需血清稀释倍数的倒数表示，并以抑制剂量形式报告。

四、基于高内涵显微成像法的假病毒中和试验自动化

另一类假病毒中和试验采用高内涵显微成像读出方式。靶细胞在中和实验前一天接种于384孔组织培养板上。病毒接种液滴度经过调整，使单层细胞感染率不超过10%，以确保检测处于线性工作范围内。

血清稀释与加样

血清稀释液通过Echo 650声波移液系统加入靶细胞中，最终在含10%胎牛血清的DMEM培养基中达到指定稀释倍数。每种血清稀释度均设置三个重复。

成像检测与IC50评估

加入病毒后孵育48小时。随后使用Hoechst 33342进行细胞核复染，并通过计算表达GFP的细胞百分比评价转染效率。检测由MD ImageXpress® Micro共聚焦高内涵显微成像系统完成。

中和作用通过计算假病毒残余转染活性进行衡量，未处理样品作为100%参照。数据分析采用GraphPad Prism软件，基于最小二乘法的可变斜率模型拟合S型曲线，并计算IC50值。

血清学研究设计

相关研究中，对两组受试者样本进行了血清学分析：

·       既往未产生过免疫应答的BTN162b2 mRNA疫苗接种者（N组，n=50）

·       既往感染过SARS-CoV-2的个体（P.I.组，n=51）

检测指标包括：

·       针对SARS-CoV-2刺突蛋白（S）的IgG、IgM和IgA

·       针对核衣壳蛋白（N）的IgG

同时评估了接种前、第一剂后及第二剂后采集血清的中和活性。

五、基于微球的多重抗体结合测定法

基于微球的多重抗体结合测定法用于分析不同抗原背景下的抗体结合情况。相关实验中，所使用样本包括：

·       经加热灭活、分别以50 μg的SpFN或PBS进行两次免疫接种的恒河猴血清

·       纯化单克隆抗体

样本通过Biomek NXP®自动化液体处理工作站稀释后移液至384孔检测板中。

该方法中，将以下抗原偶联至编码磁性微球：

·       11种覆盖SARS-CoV-2或SARS-CoV-1的Spike S1和S2结构域抗原

·       1种对照蛋白（HIV1抗原）

随后，将上述复合物以每孔50 μL终体积加入96孔板中，在剧烈振荡条件下孵育2小时。孵育后，使用磁性384孔自动化洗板仪去除未结合样品。

洗涤后，用0.5 μg/mL的小鼠抗人IgG-PE重悬微球，并在3,000 rpm微孔板涡旋仪上振荡1分钟，经超声处理1分钟后，在剧烈振荡条件下继续孵育1小时。最后再次洗涤，使用40 μL鞘液重悬微球并进行检测。

六、基于Biomek NXp的假病毒中和试验流程

除上述流程外，还可采用表达hACE2的HEK293靶细胞并结合Biomek NXp自动化液体处理工作站完成假病毒中和试验，用于测定病毒感染性和中和效价。

实验流程包括：

·       样品在生长培养基中按1:40进行起始稀释，并进行倍比稀释

·       每孔加入25 μL至白色96孔板中

·       纯化单克隆抗体起始浓度为1 mg/mL

·       每孔加入等体积稀释后的SARS-CoV-2 pSV

·       于37℃条件下孵育1小时

·       向各孔加入靶细胞40,000个/孔

·       继续孵育48小时

·       使用多功能酶标仪测定RLU

中和效价—反应曲线采用LabKey服务器进行非线性回归拟合，最终报告达到50%中和和80%中和时所需血清稀释倍数的倒数或对应抑制浓度，即ID50 / IC50和ID80 / IC80。

七、mRNA递送治疗性抗体与抗药抗体（ADA）检测

除疫苗开发外，mRNA技术还可用于递送治疗性单克隆抗体（mAb）及其他生物制剂。与传统以蛋白形式递送的治疗性mAb不同，工程化人源IgG1 mAb可通过包封于脂质纳米颗粒（LNP）中的mRNA进行静脉内递送，并在受体内转录成蛋白。

该类生物制剂通常具有一定免疫原性，可能诱导产生抗药物抗体（ADA）。抗mAb ADA可导致：

·       治疗性mAb中和

·       mAb清除加快

·       功效下降

同时，也可能与严重急性反应及长期免疫复合物相关疾病有关。因此，在临床前与临床研究中，ADA诱导筛选及其后果评估通常是生物制剂开发中的重要组成部分。

八、桥接ELISA自动化平台与方法学验证

用于大鼠抗体筛选和确证的桥接ELISA自动化方法，可对以下性能进行评价：

·       特异性

·       灵敏度

·       选择性

·       无前区效应

·       线性

·       试验内精密度

·       试验间精密度

·       鲁棒性

自动化平台组成

相关平台包括：

·       Biomek i7液体处理工作站（配置span-8和1200 μL 96孔头）

·       405LS洗板机（BioTek）

·       SpectraMax 384 Plus酶标仪（MD）

·       储板站

软件部分包括：

·       Biomek软件：用于设计并优化移液参数

·       SAMI EX排程软件：用于设计和执行测定工作流程

·       SoftMax：用于酶标仪数据采集

·       DART：用于数据存储和报告

SAMI EX动态排程与板间精密度

SAMI EX可根据批处理大小和用户设定的可接受时序范围进行动态排程，以最小化总运行时间。由于不同批次大小对应的时间和顺序可能发生变化，因此单批次中不同板的结果，或单板与四板排程之间的结果可能存在差异。

为评估筛选试验的板间精度，在单次筛选测试中，对高、中、低和阴性对照组各设置四份样本，并在四块板上分别设置四个复孔。结果显示，各板中A450与anti-ID水平成正比，且A450板间**%CV均低于10%**：

·       高对照：1.8%

·       中对照：3.8%

·       低对照：9.5%

·       阴性对照：7.9%

这些%CV与板内精度结果接近，且明显低于检测间%CV。采用Bonferroni多重比较检验进行双因子方差分析，结果为p=0.17，表明单次四板测试中的阳性对照组与四次独立单板测试的归一化结果之间无显著差异。

九、ADA Screening ELISA与Confirmatory ELISA的自动化应用

基于上述验证结果，大鼠ADA Screening ELISA和Confirmatory ELISA实现了自动化开发，并用于评价LNP包封、编码DH1042的mRNA给药后大鼠血清中的抗DH1042抗体。

给药设计与结果

实验中，大鼠接受两个剂量的LNP-mRNA给药，单次剂量分别为：

·       0.1 mg/kg/剂量

·       0.4 mg/kg/剂量

·       0.6 mg/kg/剂量

两次给药间隔为8天。第二次给药后21天，不同剂量组中有**50%–100%**的大鼠检测到确认阳性的抗DH1042抗药抗体（ADA），对照组中未观察到抗DH1042 ADA。

Screening ELISA流程

Screening ELISA包括以下步骤：

1.       抗体包被

2.       洗板封闭

3.       加样（按1:10稀释至最小所需稀释度MRD），设置四个复孔

4.       加入生物素标记抗体

5.       加HRP标记链霉亲和素

6.       TMB显色

7.       450 nm读数

图 ADA-RAT-screening assay 1~6步

图 ADA-RAT-screening assay 6~7步

Confirmatory ELISA流程

Confirmatory ELISA在Screening ELISA基础上增加了游离抗体竞争结合步骤，通过比较有无竞争条件下的信号变化，用于排除假阳性结果。

十、结论

在mRNA疫苗研发与抗体评价相关流程中，自动化平台已覆盖高通量构建、假病毒中和试验、多重抗体结合分析和抗药抗体桥接ELISA等多个实验环节。贝克曼库尔特（Beckman Coulter）生命科学相关平台在上述流程中的应用，主要体现在自动化液体处理、检测流程衔接、动态排程执行和数据采集支持等方面。

对于中和活性、抗体结合水平和ADA检测结果的解读，仍需基于具体样本、生物体系、实验设计及统计分析方法综合判断。自动化平台在此类研究与方法开发中承担的是流程执行与标准化支持角色。

FAQ

1. 贝克曼库尔特（Beckman Coulter）相关平台在mRNA疫苗研发中主要覆盖哪些实验环节？

主要包括高通量构建、假病毒中和试验自动化、多重抗体结合测定以及抗药抗体（ADA）桥接ELISA自动化等环节。

2. 假病毒中和试验为什么适合自动化？

假病毒中和试验具备较好的安全性、规模化适配性和自动化兼容性，因此适合与自动化液体处理、培养和检测平台整合使用。

3. Echo 650在高内涵显微成像法中承担什么作用？

Echo 650主要用于将血清稀释液加入靶细胞中，以实现设定稀释倍数和重复条件下的自动化加样。

4. Biomek i7在ADA检测中起什么作用？

Biomek i7主要用于桥接ELISA流程中的自动化液体处理执行，并与洗板、读数和排程系统协同完成实验流程自动化。

5. 相关自动化平台是否直接决定免疫学结果？

相关平台主要用于实验执行、流程标准化和数据采集支持；具体免疫学结果仍取决于样本、生物体系、试验设计及分析方法。

参考文献

1、Antibody escape and cryptic cross-domain stabilization in the SARS-CoV-2 Omicron spike protein

2、Mucosal adenovirus vaccine boosting elicits IgA and durably prevents XBB.1.16 infection in nonhuman primates

3、Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve

4、Diverse array of neutralizing antibodies elicited upon Spike Ferritin Nanoparticle vaccination in rhesus macaques

5、ALFQ adjuvanted HIV-1 envelope protein vaccination elicits durable functional antibody and cellular responses in nonhuman primates

6、A scalable serology solution for profiling humoral immune responses to SARS-CoV-2 infection and vaccination

7、The anti-SARS-CoV-2 monoclonal antibody, bamlanivimab, minimally impacts the endogenous immune response to COVID-19 vaccination

8、Development and validation of an automated assay for anti-drugantibodies in rat serum